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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种严重的进行性神经退行性疾病，具有较长的前期症状、早期诊断困难，临床特征为认知障碍、精神行为问题和社会及生活功能丧失，最终导致死亡。目前，AD患者可用的治疗药物非常有限，主要分为胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸受体拮抗剂、及新近批准的Aβ单抗药物等。
美迪西建立了一站式临床前生物医药研发服务平台，为阿尔茨海默病药物的开发提供药物发现、药学研究、及临床前研究服务（包括药效、药代、安评）以及IND申报等一站式服务。
在美国，据估计目前有690万65岁及以上的人患有阿尔茨海默病[1]。预计到2060年，该患病率将翻倍，可能会增长到1380万以上，造成重大的社会和经济负担。阿尔茨海默病患者的比例随着年龄的增长而增，5.0%的65岁至74岁的人、13.2%的75岁至84岁的人、33.4%的85岁及以上的人患有阿尔茨海默病。阿尔茨海默病是65岁及以上美国人死亡的第五大原因，在2000年至2021年期间，阿尔茨海默病报告的死亡人数增加了140%以上。然而，目前还没有行之有效的方法来预防阿尔茨海默病，也没有治愈的方法。
阿尔茨海默病的多种病理机制[2]
多靶点配体（Multi-target-directed ligands, MTDL）设计策略是利用具有两种或两种以上互补生物活性的单一化合物，对AD的复杂病理机制产生协同作用，从而显著改善记忆和认知障碍。因此，目前的方法大多是基于分子杂交，将两个或多个具有特定性质的药效团组合在一个分子中，从而获得能够有效抗AD的多靶点活性化合物。
设计多靶点配体(MTDL)分子的三种可用的策略示意图[3]
MTDL大分子角色于这五种或这五种以内与常见疾病关联的靶点，既使，由这些单靶点类药物结构的联办做法也应该达到相仿的做法感觉。在佳环境下，MTDL做法要高于联办做法，毕竟它即调取了联办做法的因此有什么好处，并添加好几回些格外的益处。举例， MTDL用于从单一氧化物，应当无食用的食用的治疗药物治疗-食用的食用的治疗药物治疗完美能力的危险因素，且与各种食用的食用的治疗药物治疗完美能力的危险因素也较低。不仅，越低的食用的食用的治疗药物治疗搭档，时有发生不健康体现的或许性越高，MTDL原子不健康体现的危险因素也会降低。另一类个优缺点是，MTDL办法是还简化了给药设计，而的提升了病号依从性。在哪些 情況下，联席治療就可以依据在那种口服药注射剂中动用多少种单靶点口服药的稳固用药量组成，来缓解上述问題。因此，这类口服药组成遭受各种组分不相同药代运转学的反应，在给药时应要特别是目光。第三，一直以来FDA在公布的用量联席设计规划白皮书来适配用量联席调理临床实验上耐压，但与联席调理不同之处，MTDL原子的设计规划还要的临床实验上耐压少得多。乙酰胆碱酯酶（AChE）是阿尔茨海默病治疗的经典靶点。胆碱能假说认为，海马体和新皮质区的神经递质乙酰胆碱（ACh）在学习和记忆中起着关键作用，胆碱能神经元的破坏或丢失，引起乙酰胆碱水平的显著下降是阿尔茨海默病患者认知障碍的主要原因。
在身理经济条件下，AChE能优质地将乙酰胆碱蛋白质水解成胆碱和乙酸根阴阳离子。因，限制AChE就能很好的加强突触缝隙乙酰胆碱溶度，使其成胆碱能程序的核心靶点。FDA批准了多种AChE抑制剂（AChEIs）用于治疗AD，证明了AChE抑制剂的治疗价值，包括多奈哌齐、加兰他敏、利斯的明、他克林、石杉碱甲（中国批准）。
此外，AChE在AD的发展中还具有非胆碱能功能。研究发现，AChE外周阴离子位点（PAS）能催化Aβ聚集，特别是Aβ1-42的聚集导致大脑中老年斑的形成，且与神经变性有关。适当的AChEIs可以抑制AChE诱导的Aβ的聚集和纤维化，表明AChEIs在抗AD治疗中具有多功能作用。
在可能会产生AD的多种多样诱因中，Aβ积聚和Tau淀粉酶过渡磷碱化已被比较广泛认同。Tau淀粉酶假说看做，微管解聚和中枢感觉神经黏胶纤维缠结的引发，主要是是由Tau淀粉酶过渡磷碱化引发的，t加速了中枢感觉神经元组织细胞的变形和挫裂，产生病毒的参与性严重。糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）催化的Tau蛋白过度磷酸化，主要发生在Ser-396、Ser-199和Ser-404位点，增加了额外的2-7个磷酸基团的数量，并减弱了Tau蛋白与微管的粘附作用。随后，过度磷酸化的Tau蛋白与微管分离，聚集成不溶性的神经纤维缠结，导致微管结构不稳定，最终导致细胞死亡。因此，抑制Tau蛋白信号通路上游的GSK-3β能够稳定微管系统，减少细胞内神经纤维缠结的形成。
其次，GSK-3β确认增加β-分泌物酶（BACE1）的抗逆性来有助于Aβ的制造，Aβ沉积物并决定性影响老年人斑的生成，可抑制GSK-3β可确认缩短Aβ的生成而福射到Aβ数据信息通道。长期以来GSK-3β在AD麻烦病理学中的根本效应，可抑制GSK-3β概率是一款有效率的抗AD方法。如下图所示：该类化合物保留了他克林结构，主要用于保留AChE抑制作用；另外保留了芳香族环取代嘧啶酮的结构，用于维持潜在的GSK-3β抑制作用（嘧啶酮结构是该类化合物发挥GSK-3β抑制作用的关键药效团）；中间采用烷基胺linker来桥接上述两种药效团。基于多靶点抗AD策略，该类化合物旨在缓解胆碱能缺陷，协同消除细胞内神经纤维缠结。
具有AChE/GSK-3β双重抑制作用的他克林-嘧啶类化合物的设计[4]
交融他克林和嘧啶酮的最新型骨架有机化合物，经途组成方面推广以维护和激发靶点紧密联系影响，包含他克林方面的改变基团推广，各类对烷基胺linker和嘧啶精彩片段确定掩盖。在1次相继优化系统，并举行了大量的药理学科学试验来研究分析它们之间的类药理作用质，获取了对AChE和GSK-3β一起存在正常的克制抗逆性的最好化系统合物27g（IC50 = 51.1 nM for AChE; IC50 = 89.3 nM for GSK-3β）。❖ SH-SY5Y神经元细胞暴露于糖酵解抑制剂甘油醛（GA），导致糖酵解抑制、细胞凋亡和Tau蛋白磷酸化增加。在SH-SY5Y细胞中，化合物27g能够剂量依赖性地抑制GA诱导的Tau蛋白S199和S396位点的磷酸化，其在较低浓度（10 nM）下对p-Tau有明显的抑制作用，在较高浓度（0.5 μM和5 μM）下对p-Tau的改善效果与空白对照组接近。
❖ 对于GA诱导的不良反应，通过细胞活力测定和形态学研究，证实了化合物27g对SH-SY5Y神经元细胞有明显的神经保护作用。
❖ 采用东莨菪碱诱导的认知受损ICR小鼠模型，使用Morris水迷宫（MWM）试验来评价化合物改善小鼠认知障碍的体内疗效。空白对照组认知行为表现最佳（逃避潜伏期、搜索距离和到达次数分别为9.40 s、2.07 m、n = 6.79），东莨菪碱组认知能力表现相对较差（分别为23.81 s、5.00 m、n = 3.63），化合物27g（15 mg/kg/day）处理的样品组能够显著改善东莨菪碱引起的认知和记忆损伤（分别为11.86 s, 2.46 m, n = 6.44），且在相同给药剂量下与阳性对照他克林的疗效相当，表明27g作为AChE抑制剂可增强胆碱能信号通路。
Morris水迷宫实验评价化合物对东莨菪碱诱导的ICR小鼠认知功能障碍的影响[4]
研究发现，在AD患者死后脑切片中发现AChE活性大量降低，而丁酰胆碱酯酶（BChE）活性大量升高。在生理条件下， AChE在肌肉和神经系统中占主导地位，并伴有较低水平的BChE。
然而，BChE的代偿性作用在病理条件下是非常明显的。在AChE敲除小鼠模型中，由于AChE缺乏，BChE被证明可以补偿ACh水解，从而维持正常的胆碱能通路。在晚期AD患者中，脑内乙酰胆碱酯酶水平急剧下降90%，而BChE则上升至正常水平的165%，接替乙酰胆碱酯酶的水解功能。因此，BChE是治疗晚期AD治疗的潜在靶点。
除了胆碱能功能外，BChE已被证明与Aβ高度相关。组织化学定位研究表明BChE沉积与老年斑中进行性Aβ聚集密切相关。
此外，在BChE敲除小鼠模型中，大脑中的Aβ纤维显著减少，表明BChE可能促进Aβ沉积。研究发现，注射神经毒性Aβ25-35后，BChE基因敲除小鼠的认知能力不受影响，而野生型小鼠在给药后出现认知损伤。因此，BChE抑制可能是清除Aβ的有效策略。
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）通过调节组蛋白和一些非组蛋白的乙酰化状态来调控基因表达。尽管HDACs已被证明是治疗癌症的有效靶点，但近年来，抑制HDAC在治疗神经退行性疾病方面也引起了极大的关注。其中，HDAC6是哺乳动物细胞中主要的细胞质去乙酰化酶，其胞质定位使得HDAC6更倾向于靶向非组蛋白，在神经退行性疾病中得到了较为广泛的研究。
AD患者神经原纤维缠结（NFTs）的形成与Tau蛋白的过度磷酸化高度相关，而Tau蛋白的过度磷酸化受HDAC6调节。HDAC6在AD患者大脑皮层和海马体中的过度表达破坏了微管蛋白的转录后调控，微管蛋白是微管的组成部分，也是轴突运输的关键组成部分。HDAC6抑制剂可以提高α-微管蛋白的乙酰化水平，从而促进Aβ和磷酸化Tau的清除，改善认知。
如下图所示，基于该研究者之前发现的BChE抑制剂S11-1014，通过融合BChE抑制剂和典型的HDAC6抑制剂核心药效团结构，开发了一系列新型的N-苄基苯甲酰胺类衍生物，作为有效的BChE/HDAC6双重抑制剂。通过构效关系（SAR）研究，发现了两种化合物（化合物24g和29a）对BChE（hBChE IC50分别为4.0和1.8 nM）和HDAC6（IC50分别为8.9和71.0 nM）具有较好的抑制活性。
N-苄基苯甲酰胺类BChE/HDAC6双重抑制剂的设计[5]
化合物24g和29a的结构式[5]
无机单质24g和29a对表示性HDAC亚型的进行性进行了鉴定，这2种无机单质都能以高进行性地可抑制HDAC6。❖ Western blot毕竟展现，类化合物24g和29a均能氨水浓度依耐性地上升乙酰化α-微管蛋白质酶程度，且特征出对磷碱化Tau蛋白质酶的比较突出仰制和合适的的天然免疫的调节反应。❖ 肿瘤細胞的水平试验表明阳极氧化物24g和29a毒副影响低，能更好保障性谷氨酸和过阳极氧化氢介导的肿瘤細胞受损，体现了突出的面神经保障性影响，及缩减活力氧(ROS)的移除。❖ 体内研究表明，化合物24g和29a在低剂量（2.5 mg/kg）下对Aβ1-42诱导的AD模型小鼠表现出明显的认知改善作用。通过Morris水迷宫和Y迷宫测试，如下图A、B所示，对照组和假手术组在到达平台的潜伏期、运动轨迹和交替表现上均无显著差异。然而，模型组小鼠轨迹混乱，目标潜伏期不明显，交替表现较弱。
在Morris水迷宫实验英文中，单质24g和29a除理的小鼠痕迹更整洁，寻觅软件的准确时间更短，两种方式单质的可行性与弱阳相较比较（ChE控药剂型rivastigmine）非常，高于HDAC控药剂型弱阳相较比较（SAHA和TubA）。在Y迷宫测试测试中，从下面的图C能能听出，24g和29a组与三维对模型组比起来，小鼠组织循环的能力素质物有所的提升（差别为75.59%和77.82%，三维对模型组为47.19%），且略好于3个阳型药剂组。
化合物24g和29a对Aβ1-42诱导的AD模型小鼠认知缺陷的影响[5]
[1] Alzheimer’s Association. 2024 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s Dement. 2024, 20: 3708–3821.
[2] K Rajasekhar, et al. Current progress, challenges and future prospects of diagnostic and therapeutic interventions in Alzheimer's disease. RSC Adv. 2018, 8(42): 23780-23804.
[3] Ondrej Benek, et al. A Perspective on Multi-target Drugs for Alzheimer's Disease. Trends Pharmacol. Sci. 2020, 41(7): 434-445.
[4] Hong Yao, et al. Discovery of Novel Tacrine-Pyrimidone Hybrids as Potent Dual AChE/GSK-3 Inhibitors for the Treatment of Alzheimer's Disease. J. Med. Chem. 2021, 64(11): 7483-7506.
[5] Lei Wang, et al. Design, Synthesis, and Proof of Concept of Balanced Dual Inhibitors of Butyrylcholinesterase (BChE) and Histone Deacetylase 6 (HDAC6) for the Treatment of Alzheimer's Disease. ACS Chem. Neurosci. 2023, 14(17): 3226-3248.
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