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1、cAMP是很小的分子,并且在体内是天然存在的,怎么获得cAMP的抗体的?
侯利苹博士:小分子通常被定义为半抗原,本身难以刺激机体产生免疫反应,也不容易诱导抗体生成。为了获得针对小分子的抗体,一般是将小分子(如cAMP)与大分子载体(如BSA)结合,使其能够被免疫系统识别,然后免疫动物并利用杂交瘤技术获得单克隆抗体。
2、美迪西是否对外承接GPCR细胞株构建服务。一般需要多久?
侯利苹博士:我们可以承接GPCR细胞株构建业务,在构建细胞株的过程中,首先需要进行慢病毒质粒合成,这个一般需要2到3周,完成质粒合成后,我们进入病毒包装阶段,这一过程大约需要1周。接下来构建混合克隆,我们需要进行抗生素筛选和扩增,这一阶段大约需要2周,获得混合克隆是6周。如果后续检测需要单克隆细胞,我们将使用流式细胞仪将细胞分选至96孔板中进行培养。单克隆细胞的生长和扩增过程大约需要1个月,之后的扩增和检测需要2周。
但是,所有准确时间阶段为:质粒提炼正常2-3周,细菌内包装1周,混杂克隆需求2周,单克隆需求6周,即取回来混杂克隆6周,取回来单克隆12周。3、钙流检测实验中,细胞密度为什么选择5,000细胞/孔?
侯利苹博士:5,000细胞/孔是我们常用的密度。由于钙流检测需要读取光信号,细胞需要均匀铺满孔底,避免密度过高导致信号干扰。当然,根据细胞类型和实验需求,这一密度也可以根据细胞密度适当调整。
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(1) 靶点功能研究: 评估GPCR激活和信号通路转导,包括cAMP、Ca2+等信号通路分析。
(2) 高通量筛选: 利用报告基因法、HTRF法、钙流检测等筛选GPCR激动剂和拮抗剂。
(3) 药物活性评估: 提供亲和力测定、IC50/EC50计算及分子机制研究。