原位杂交（insituhybridization）用特定标记的已知碱基序列核酸作为探针与组织、细胞中待检测核酸按碱基互补配对的原则在原位进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的监测系统，通过免疫组织化学方法在被检测核酸原位进行细胞内核酸定位。原位杂交可根据检测物而分为细胞内和组织切片原位杂交；根据其用探针及检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA杂交。根据标记方法不同可分为放射性探针和非放射性探针。

其基本性措施是指：固定好、薄片、混种杂交、显色等主要的步聚。

(一)取材与标本固定
1． 标本　相对于原位混种杂交所使用的的原材料要尽可以鲜美，想要放置RNA的分解，标本要快，标本后要快点固定位置或冰冻保持。
2．放置　实行原位有性杂交的进行安排或体体体受损细胞必要历经放置加工，放置的原因是只为①始终保持体体体受损细胞结构设计和原有结构设计；②最大程度程度永久保存体体体受损细胞内的DNA或RNA的程度；③使测试探针有利进行体体体受损细胞或进行安排内。
3．稳固液　通用稳固液有10％有害气体、4％多聚有害气体、冰乙酸-朗姆酒相溶液、Bouin氏稳固液等。这种稳固液常有不一的优劣势于是要给出中应的检测對象，选用最佳选择的稳固液。
4．比较固定位置不动策略　组建动物界标本材料后，很快放进去比较固定位置不动液中2～4h，材料组建面积大小为1cm×1cm×0.5cm，为宜变小。必备时，动物界组建可确定灌流比较固定位置不动，并且将组建按想要材料放进去20%白砂糖中，4℃留宿，第二天准许冻成切块。

(二)切片及细胞标本的制备
1．载玻片的处置　这是由于原位改良品种一样在载玻片努力行，以载玻片需稳定洁面且不会有每核酸酶的环境破坏。一样载玻片可先经冼衣粉净泡隔夜，用银行工资流水清洗道路、酸中净泡4～8h，在用银行工资流水清洗道路，双蒸熨烫2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。若为经15磅高压力灭菌处置20min处置，可将载玻片上的核酸酶解决。
2． 组织开展切成片与预办理
（1）冷藏薄片：新颖企业也可在留取后，直接性置于液氮中短时间骤冷，速冻薄片后，4％多聚室内甲醛固定住5～10min，也可保留在-70℃中五定。交配前薄片短时间可以恢复至室内温度并空气干燥，0.1mol PBS洗十次，2×SSC洗10min，中滴加预交配液室内温度孵育1h。
（2）石蜡切块：集体一定后，规范石蜡包埋切块，可长时存放，实时适用原位有性杂交种育种。有性杂交种育种前切块经①二甲苯脱蜡2次，只要10min；②纯白酒洗2次，只要5min；③气流低温干燥5min；④系数白酒复洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1 mol PBS洗3次，只要5min；⑥2×SSC洗10min；⑦中滴加预有性杂交种育种液于湿盒内环境温度孵育1h。
（3）锻炼癌神经肿瘤组织：好几张载玻片加入适量200μl渗透压为1×105/m1的癌神经肿瘤组织漂浮液，空气当中干燥处理1～2min而成癌神经肿瘤组织涂片，也可间接用锻炼癌神经肿瘤组织盖片。作出癌神经肿瘤组织片经酒或多聚室内甲醛不变5min，剩下的方法流程同冻成切成片。

(三)试剂配制
配成氢氧化钠溶液流程通常情况下需戴半指手套，液态物质配成均用超净水设备，用什玻璃瓶均经160℃烘烤4h，核心最终目的是除去RNA酶。
1． DEPC水　将DEPC按1‰酸度融入超净化水中，积极相混后静置隔夜，15~20min高压力紫外线灯消毒，在这之后温度避尘停放。
2． 0.1mol PBS　pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4为NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04为Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其盐浓度达0.85％。
3． 20×SSC　为NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。
4． 4％多聚装修零甲醛无污染(pH 7.4)　为多聚装修零甲醛无污染4g；0.1mol PBS 100m1。
5． 保护液
（1） 降低液Ⅰ(pH 7.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；杀菌超纯水加至1000ml。
（2） 减慢液Ⅱ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；酒精消毒超清水加至1000ml。
（3） 缓冲区液 Ⅲ(pH 9.5)　为1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；杀菌消毒超水净化加至1000ml。
6． 去铝阴离子甲酰胺　将阴阳铝阴离子变换硅胶粘合剂各5g填加50ml甲酰胺中，待硅胶粘合剂下陷后用上清液。
7． 50％浓盐酸葡聚糖　5g浓盐酸葡聚糖加10ml DEPC水，迅速推动使之齐全溶解出来。
8． 50×Denhardt's液　为1％Fico11type 400（聚绵白糖） 0.2g；1％PVP（聚氯乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清廉蛋白酶）0.2g；DEPC水 20.0ml。
9． 预杂交种液　为去正离子甲酰胺5.0m1；20×SSC 2.0m1；硅鱼精DNA (10mg/m1) ；0.5ml（热水性变10min）；发酵粉tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％浓盐酸葡聚糖 2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。

(四)杂交与显色
1．混种交配育种育种　将已图标的测试探头参与预混种交配育种育种液即成为了混种交配育种育种液（测试探头浓硫酸浓度为1μg/m1），切块经2×SSC暂短浸洗后，加入适量混种交配育种育种液，于湿盒內置37℃或42℃孵育住宿。那么逐个经2×SSC温度浸洗1h，l×SSC温度浸洗lh，0.5×SSC 37℃浸洗30min，0.5×SSC温度浸洗30min。目光加入适量混种交配育种育种液时切块勿低温干燥。
2． 显色　低于各步均在温度下来进行。
（1）加载液I洗1min。
（2）用含2%普通 羊血清和0.3％TritonX-100的缓冲区液I孵育切成片30min。
（3）用含1％日常羊血清和0.3％TronX-100的缓冲器液I溶解羊抗Dig表面抗原。
（4）将抗体阳性摇匀液滴入在切开上，封口处膜覆盖面，湿盒内4℃孵育過夜。
（5）响应液I洗10min。
（6）降低液Ⅱ洗10min。
（7）加显色液，粘口膜覆盖面，背光空调温度孵育2～20h，直接镜检，当显色贴心时入加载液Ⅲ中止显色。
显色液临用前配，其材料配方为：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑      2.4mg；④缓冲器液Ⅱ 加至10ml。
（8）长规脱水器、半透、封固。
最后：杂交种阳性反应手机信号为紫紫色颗粒物。

(五)原位杂交对照试验 
同抗体进行化学物质脱色对应相同，为发现原位有性杂交育种科学试验运作的精确性性和科学试验报告的特女性朋友，必须 装置一产品对应科学试验，大概的各式对应科学试验的装置名词解释效果请可以参考原位有性杂交育种学术专著，一下仅讲述几个通常用的对应科学试验。
1．节约箭头检测器　在做原位有性杂交育种育种时，以PBS或预有性杂交育种育种液用于有性杂交育种育种液，后果因为阴，这里是的一种操作简单而故有何意义的阴较实验报告。如节约箭头检测器仍显现抗体阳性现象现象，这一些 是假抗体阳性现象。
2．自个差表　用统一阻止薄片或涂片上与靶回文序列可有可无的另两个的形式作差表。抗体弱阳与阴性生理反应的形式肩并肩两个角度中，相互之间认证，这客观实在便是对抗体弱阳生理反应的特异形差表。
3．呈阴化比　用已知a不留存根据靶字段的机构动物标本混种改良品种，最终是指呈阴化。呈阴化比可是排除在混种改良品种的过程中鉴于非特男人混种改良品种反應等情况产生的假阳型最终。
4．抗体呈阳型参考　用如图含靶字段的策划 薄片与待检样本金桥接地铜绞线——加塑铜绞线治疗，结论不得超过抗体呈阳型，称抗体呈阳型参考。实现抗体呈阳型参考可声明书混种混种流程中每一个关键步骤之一还有所使用的的化学实验试剂都完全符合条件，实验设计技巧靠普。愈加当待检样本为呈阴化时，抗体呈阳型参考片呈抗体呈阳型发生反应可避免待检样本假呈阴化的能够。故若估计混种混种结论为呈阴化时，就一定要设抗体呈阳型参考，当抗体呈阳型参考亦不显色，就声明书混种混种流程的特定关键步骤之一或常用化学实验试剂话题。