美研|CMC系列(十六)：浅析HILIC模式对大极性化合物的应用

2024-08-08

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HILIC形式简单易行价绍

HILIC是一种色谱分离技术-亲水作用色谱（hydrophilic-interaction chromatography）的简称，也称为非水反相色谱或者反反相色谱，由Alpert教授于1990年提出，并将HILIC模式和正相模式（NPLC）进行了区分^[1]。

HILIC机制和正相塑造类试的洗刷方式，仍然采用了反相直接稀释就能剂设计（水和生物碳相），然而满足正相所没能的优势可言，举例子设计中能能水分含量，针对充分物的直接稀释就能剂选用更稳地，再现性更稳，能能衔接MS做联用这些等等这些等等（HILIC机制带有高的比例生物碳相，比起来于水相更稳地的反相，更简单去直接稀释就能剂化，新增亚铁阳离子化速度，的提升迅敏度，如图已知1已知）。HILIC机制能能以免采用亚铁阳离子对免疫试剂，针对大旋光性充分物的制作很有利于。HILIC机制具有广泛性app于大旋光性充分物的转移，举例子抗癫痫药物、碳水化合物、蛋白酶、多肽、有机酸这些等等这些等等。

图1：不同模式对化合物的应用范围.png

图1：各个模型对类化合物的选用面积

HILIC模式英文帮助基本原理

HILIC的补齐逻辑是液液重新分配、吸附剂的能力、铁离子互为的能力和亲水性树脂补齐的能力等多样形式的能力的结合做到，无机化合物的补齐应该受其化学上特点和构造、进行固定相和进出相的能力各种进出相玩法（生物碳石油醚玩法各种进出相pH）导致。

HILIC模式的色谱柱的固定相采用未衍生化硅胶或杂化颗粒、酰胺基、氨基、二醇、两性离子、环糊精类、聚琥珀酰亚胺键合物质等极性填料，所以化合物的保留强度和其极性成正比，和流动相极性成反比。极性溶剂的存在可以使固定相表面形成一层极性层，如图2所示，因此对于利用液液分配作用进行保留的化合物，流动相中极性溶剂是必不可少的，一般至少包含3%极性溶剂 ^[2]。

图2：胞嘧啶在流动相和固定相表面吸附水层液液分配.png

图2：胞嘧啶在流入相和固定位置相外表面离心分离水层液液划分

在流动相中添加缓冲盐和添加剂也是常用手段，有助于改善峰型和保留，缓冲盐在面对固定相表面极性层和非极性溶剂时，更加倾向于溶解于极性层，随着盐浓度增加从而增加其亲水性，^[3]。

其中，甲酸铵和乙酸铵是最常用的缓冲盐，这得益于它们在有机溶剂中良好的溶解性以及MS兼容性。需注意的是，随着盐浓度的提高，化合物和固定相的离子作用会受到抑制，主要作用为液液分配 ^[4~7]，这就导致碱性化合物的保留减弱，是因为大量的阴离子和碱性化合物配对形成中性离子对更容易溶于有机相；相反，酸性化合物保留则会增加，是由于带负电的硅醇离子排斥作用减弱，从而与固定相作用增强。

一些固定相填料表面上具有带电硅醇，具有一定酸性，在pH5~9时，硅醇基团就处于电离状态，对于带电状态的化合物离子交换作用将扮演重要角色^[3]。需注意的是，由于HILIC模式下具有高比例有机相，高或低pH的缓冲盐溶于其中时，其真实pH值会由缓冲盐pH值向中性靠近1~1.^[8]，使化合物处于电离状态的pH值，更利于化合物的保留。

一样酸酸碱度类有机物在高pH（经最常见到氨水、碳酸氢铵等）條件下保存弱于低pH條件，酸碱度类有机物在低pH（经最常见到乙酸、甲酸、乙酸铵、甲酸铵等）條件下保存最好。

HILIC形式萃取剂决定

HILIC模式洗脱溶剂强度为：四氢呋喃 < 丙酮 < 乙腈 < 异丙醇 < 乙醇 < 甲醇 < 水（由弱至强），如图3所示，四氢呋喃、丙酮和乙腈洗脱能力最弱，可作为主要溶剂使用，由于丙酮的截止波长330nm过高，在UV检测器使用受限（可用于CAD、ELSD、MS等），而乙腈是非质子溶剂，能够增加化合物和固定相表面极性层的氢键作用，从而增加保留，因此作为最常用流动相之一，相当于反相中的水相，水的洗脱能力最强，常作为洗脱溶剂使用，可根据化合物保留情况选择合适的洗脱溶剂。

图3：HILIC模式洗脱溶剂强弱顺序.png

图3：HILIC模式切换冲洗掉石油醚中弱按顺序

HILIC形式特别留意事宜

01 稀释剂

一般建议选择流动相起始比例溶解样品。由于HILIC模式乙腈的比例较高，很多大极性化合物难以溶解，为了保证化合物溶解，通常会将大极性溶剂——如水、甲醇等应用于稀释剂。在这种情况下和常规反相分离类似，HILIC模式使用强洗脱稀释剂时也会导致溶剂效应问题。而二甲基亚砜（DMSO）作为稀释剂，具有一定保留，并且DMSO在低波长下有较强的吸收，可能会影响目标化合物出峰，一般配合乙腈、甲醇使用，DMSO比例一般不超过25%。

日常能够满足适用75%的乙腈和25%的甲醇混合型喂养液是扑灭剂，也能够加一部分插入剂助溶，如甲酸等。需要注意的是，供试品的含用水量倘若过大，也会作用有机化合物出峰情况报告。

02 洗针液

由于大极性化合物的保留极易受大极性洗脱试剂的影响，有时洗针液中的残留清洗溶剂会对化合物出峰产生影响，或者方法难以重现，一般建议采用流动相起始比例洗针。

03 流动相

为保证在分析过程中离子强度的稳定，可以在水相和有机相均加入同样浓度的添加剂，也可以考虑预混，需注意的是，在流动相配制过程中，混合后常常会产生温度变化，使用前需放置至室温。

04 色谱柱再生

液相气相色谱柱便用这段时长后，样本或者会残余在花托不通柱筛板，此时能能综合考虑完成柠檬酸铵值缓存盐低水流量完成反冲。以默克液相气相色谱柱SeQuant® ZIC-HILIC实例，最先完成30倍柱表面积的超软水完成洗，就用30倍柱表面积的缓存盐（能能用500mM乙酸铵溶剂）完成洗，结果就用30倍柱表面积的超软水完成洗，有差异组合填料解决或者有差异。

HILIC经营模式方案发掘

我们对不明氧化物的方法设计，可运用下图4所显示的基本策略确定。要特别注意力的是仍然HILIC模式，氧化物选择行为特定，特定相的旋光性水层从何而来于传递相，系数并不能变化无常过快，柱和平可以留特定时。

图4：HILIC模式未知化合物方法开发一般思路.png

图4：HILIC机制内部错误化学物质做法研发大部分难点而对于求该化学物质，则就能够按照化学物质特点来抉择，第一评判强酸强偏碱性，就能够用ACD来模拟训练，为了来气相色谱柱的抉择。

表1 色谱柱填料及应用范围.jpg

表1 气相色谱柱活性炭过滤器及应用领域面积

美迪西特色案列

01 胺类化合物

01 胺类化合物.png

氨丁三醇在常规的反相风险管理体系下都无留下，从而都无UV紫外线吸取，遂选用HILIC工艺，会选择CAD检则器实现工艺制作。氨丁三醇峰型良好的，相对性分子1.2（下图5提示），直线相关的数值r 可确保1.000，的回收利用率在97%~104%彼此。

图5：氨丁三醇典型图谱.png

图5：氨丁三醇常见图谱

02 氨基酸检测

02 氨基酸检测.png

有机酸几乎是小团伙两性情感氧化物，在一般反相分割状态下删去很弱，平常采取衍生物法进行监测，例如说说赖氨酸，其 pKa 和 logD 见如图所示：

图6：赖氨酸 pKa.png

图6：赖氨酸 pKa

图7：赖氨酸 logD.png

图7：赖氨酸 logD赖氨酸的 logD 在全部的状态下基本上负值，常用反相安全体系没有诞生抹去行为举动，公司主要采用HILIC格局避免了赖氨酸的浅析一下检则，获取了顺畅的抹去（8min）和峰型（拖尾指数1.6），大大的消减浅析一下费用，利于措施转意和检则（如同8如下图所示）。

图8：赖氨酸典型图谱.png

图8：赖氨酸常见图谱

03 大极性杂质

针对于找不到留下、找不到分光光度计吸附、不可以碰水、正负极和主成分表靠近的溶物，该怎么定性分析呢？美迪西写出的你想要的答案是HILIC-MS传统模式。如葡甲胺的发补溶物含有同一个席夫碱，该有机物正负极大、找不到分光光度计吸附、见水易吸附，该溶物和葡甲胺正负极靠近，常规化工艺其特性很难分离出来。用HILIC-MS模式切换来进行形式步骤开拓，决定性葡甲胺和该席夫碱其它杂物分开度在2.8以内，规则化对应公式r为1.000，200ppm的LOD信噪比最窄为25，二手回收并率在94%~103%之間，且形式步骤耐穿性好的，各主要参数小变下，均可提高1.5以内基线分开，二手回收并率在98%~102%之間。

图9：分离度溶液典型图谱.png

图9：隔离度氢氧化钠溶液典型的图谱

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（撰稿：李墨；编审：杜建，毕增）参照数据：

[1] Alpert, A. J., J. Chromatogr. 1990, 499, 177-196.
[2] Waters亲水作用色谱, Eric S. Grumbach 和 Kenneth J. Fountain
[3] Jandera, P., J. Sep. Sci. 2008, 31, 1421–1437.

[4] Strege, M. A., Anal. Chem. 1998, 70, 2439-2445.
[5] McCalley, D. V., J. Chromatogr. A 2007, 1171, 46-55.
[6] Naidong, W., J. Chromatogr. B 2003, 796, 209-224.
[7] Liu, M., Ostovic, J., Chen, E. X., Cauchon, N., J. Chromatogr. A 2009, 1216, 2362-2370.
[8] Fountain, K. J., Xu, J., Diehl, D. M., Morrison, D., J. Sep. Sci. 2010, 33, 740-751.

美研|CMC系统回想

❖ CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

❖ CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

❖ CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

❖ CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

❖ CMC系列(五)|药物晶型控制策略

❖ CMC系列(六)|含氮类化合物-可挥发碱性有机胺的气相分析

❖ CMC系列(七)|新药研究中的固态开发挑战及应对策略

❖ CMC系列(八)|浅析ICH指导原则Q3C及未收录残留溶剂限度制定方法

❖ CMC系列(九)|定量核磁应用及其方法验证/定量核磁那些事儿

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